Neuroinvaziunea prin coronavirusuri respiratorii umane

Probele de creier. Probele de creier codate congelate de la pacienții cu SM și donatorii de control au fost primite de la următoarele bănci de creier: The Multiple Sclerosis Society Tissue Bank, Institute of Neurology, University of London, London, Marea Britanie (Jia Newcombe); Laboratoire de Neuropatologie Raymond Escourolle, Groupe Hospitalier Pitié-Salpétrière, Paris, Franța (Jean-Jacques Hauw și Danielle Seilhean); Rocky Mountain Multiple Sclerosis Center Bank Tissue, Englewood, Colo. (Cătălin Butunoi și Ronald S. Murray); Scleroza multiplă umană Neurospecimen Bank, West Los Angeles VA Medical Center, Los Angeles, California.) (Virginia Sanders și Wallace W. Tourtellotte); Centrul de Cercetări al Spitalului Douglas, Brain Bank, Universitatea McGill, Verdun, Québec, Canada (Danielle Cécyre, Yvan Dumont și Rémi Quirion). Probele au fost depozitate la -70 ° C.

ARN, RT-PCR și hibridizare sudică. ARN celular total din țesuturile creierului uman a fost extras așa cum s-a descris deja ( 4 ). Pe scurt, țesuturile au fost lizite cu tampon de izotiocianat de guanidinium și apoi stratificate pe o pernă de clorură de cesiu pentru o centrifugare de 12 până la 20 h la 150.000 × g. Peletul a fost resuspendat în ARN H ₂ O. Perechile de primeri utilizați pentru amplificarea ARN de HCoV-OC43, HCoV-229E și MBP (genei de control intern) sunt descrise în Tabelul 1. Patru patru picomoli ale primerului invers complementar au fost incubate cu ARN celular total la 65 ° C timp de 5 minute pentru a denatura ARN; aceasta a fost urmată de o răcire lentă până la 37 ° C pentru recoacere. Transcrierea inversă cu virusul leucemiei murine Moloney revers transcriptază (38 U; Farmacia, Baie d’Urfé, Québec, Canada) a fost efectuată la 42 ° C timp de 90 min în prezența unui amestec de 48 până la 75 U de ARN Guard (Farmacia) , 0,4 mM (fiecare) deoxinucleozidă trifosfat (dNTP) (Farmacia) și 1 × tampon de transcriptază inversă (50 mM Tris-HCl [pH 8,0], 62,5 mM KCl, 3 mM MgCl ₂, 10 mM ditiotreitol [DTT]). Condițiile optime de PCR au fost determinate cu ADNc transcris din ARN-uri cu control pozitiv. Pentru PCR, o cincime din ADNc sintetizat a fost incubată în prezența fie a 20 (perechi de primer și O3, O7 și O9, cât și perechi de primer M1 și M3) sau 50 pmol (E7 și E9 și E11 și E13) primer și sens antisens, cu 2.0 (perechi de primer E7 și E9 și O7 și O9), 2,5 (perechi de primer O1 și O3 și M1 și M3) sau 4,0 mM (pereche de primer E11 și E13) MgCl ₂(Roche Diagnostics, Laval, Québec, Canada), 1 × tampon PCR (10 mM Tris-HCl [pH 8,3], 50 mM KCl; Roche Diagnostics), dNTP (0,2 mM dATP, dCTP și dGTP și 0,6 mM dUTP; Roche; Diagnostice) și 2 U de ADN glicozilază uracilă (UNG; Roche Diagnostics) la 20 ° C timp de 10 min (eliminarea UNG a eventualei contaminări potențiale dintr-o PCR anterioară) și apoi la 94 ° C timp de 10 min (inactivarea UNG și denaturarea de ADN) și, în final, la 60 ° C pentru încă 5 minute (recoacere). După adăugarea de TaqADN-polimerază (2,5 U; Roche Diagnostics) 30 de cicluri de 2 min la 72 ° C, 1 min la 94 ° C și 2 min la 60 ° C, cu o etapă finală de alungire de 10 min la 72 ° C. Ampliconii ADN au fost separați prin electroforeză într-un gel de agaroză 1,5% (greutate / volum). Hibridizarea sudică a fost efectuată pe ampliconi conform tehnicilor standard folosind o oligonucleotidă internă marcată cu ³² P (O2, O8, E8, E12 sau M2; Tabelul 1). Adecvarea ARN pentru amplificarea RT-PCR a fost verificată printr-un specific RT-PCR pentru un control intern, ARN MBP. Am lucrat în condiții foarte stricte pentru a evita orice contaminare cauzată de virusurile de laborator sau ampliconele anterioare de PCR. Au fost utilizate pipete cu deplasare pozitivă și sistemul de prevenire a transferului UNG. Mai mult, a fost aplicată o separare fizică strictă a zonelor pre și post-PCR. ARN extras din celulele infectate (celule HRT-18 infectate de celulele HCoV-OC43 și L-132 infectate de HCoV-229E) au fost utilizate ca martori pozitivi în RT-PCR. Un control negativ constând dintr-o soluție de amestec principal fără ARN sau ADNc adăugat a fost inclus în fiecare reacție de RT și, respectiv, PCR și s-a pus și pe fiecare gel de agaroză care a fost transferat în cele din urmă pe o membrană de nailon și hibridizat cu o oligonucleotidă marcată cu radiomarcă. Sensibilitatea combinației testelor RT-PCR și Southern a fost estimată prin prepararea ARN-ului transcris in vitro din gena N clonată în vectorul pGEM-T așa cum este descris mai jos („Prepararea riboprobilor”). ARN-ul a fost purificat dintr-un gel de agaroză, cuantificat prin măsurători de spectrometrie, apoi diluat și utilizat pentru a efectua RT-PCR și hibridizarea Southern în aceleași condiții utilizate pentru ARN-ul cerebral. Sensibilitatea testului nostru de hibridizare RT-PCR / Southern a fost estimată la 10 și apoi diluat și utilizat pentru a efectua RT-PCR și hibridizarea Southern în aceleași condiții utilizate pentru ARN-ul creierului. Sensibilitatea testului nostru de hibridizare RT-PCR / Southern a fost estimată la 10 și apoi diluat și utilizat pentru a efectua RT-PCR și hibridizarea Southern în aceleași condiții utilizate pentru ARN-ul creierului. Sensibilitatea testului nostru de hibridizare RT-PCR / Southern a fost estimată la 10² copii ale genei N virale (datele nu sunt prezentate). Nu considerăm că este posibil ca secvențele virale detectate de RT-PCR să fi fost ADN, deoarece RT-PCR specific MBP a cuprins diferiți exoni. O contaminare cu ADN ar fi fost detectată de un produs PCR mai mare decât era de așteptat fără introni, lucru pe care nu l-am experimentat niciodată cu numeroasele probe pe care le-am manipulat.

PCR cuibărit, clonare și secvențiere de ampliconi. Deoarece produsele PCR nu au fost detectate de cele mai multe ori pe un gel de agaroză, s-a efectuat un PCR cuibărit pe ampliconi care au fost pozitivi pentru prima rundă, detectați prin hibridizarea sudică, pentru a obține suficient material pentru clonare și secvențiere. Produsele PCR care au dat un semnal pozitiv în Southern Blotting au fost utilizate pentru PCR cuibărită pentru a permite secvențializarea anumitor ampliconi. Zece microlitri dintr-o diluție 1/100 a primului produs PCR au fost incubate cu 50 pmol (O1.1 și O3.1 și E7.1 și E9.1 perechi de primer) cu primer și sens antisens – 0.4 mM (fiecare) dNTP- 1 x PCR tampon 2,5 mM MgCb ₂ timp de 5 minute la 94 ° C și apoi timp de 5 minute la 60 ° C. TaqS-a adăugat apoi ADN polimerază și s-au incubat tuburi timp de 30 de cicluri așa cum s-a descris mai sus. Produsele PCR au fost donate în vectorul pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) Și bacteriile albastre XL-1 și secvențiate cu un secvențitor automat (ALF; Pharmacia) în ambele direcții; cel puțin trei clone au fost utilizate pentru fiecare reacție de donare. Secvențele de nucleotide și secvențele amino prezise au fost analizate cu software-ul Geneworks, versiunea 2.5.1 pentru Macintosh (Oxford Molecular Ltd., Oxford, Marea Britanie).

Prepararea riboprobiei. ARN din celulele infectate (celule HRT-18 infectate cu celule HCoV-OC43 și L-132 infectate cu HCoV-229E; ambele tulpini de HCoV de laborator au fost obținute inițial din American Type Culture Collection) a fost utilizat pentru a amplifica un fragment din codificarea N ARN din fiecare tulpină virală cu primer descris în tabelul 1. RT a fost efectuat așa cum s-a descris mai sus. PCR a fost făcut ca pentru PCR cuibărit descris mai sus; 1/10 din ADNc a fost utilizat cu 20 pmol de primeri simțici și antisens. Produsele PCR au fost donate în vectorul pGEM-T (Promega; distribuit de Fisher Scientific Ltd., Nepean, Ontario, Canada) și apoi secvențial parțial cu un secvențiator automat (ALF; Pharmacia) în ambele direcții pentru a verifica integritatea fiecărei secvențe ca precum și orientarea acesteia. Plasmidele au fost apoi liniarizate și 1 până la 10 μg de ADN au fost transcrise în ARN timp de 2 ore la 37 ° C în prezența unui amestec format din SP6 sau T7 ARN polimerază (20 U; Roche Diagnostics), 40 mM Tris-HCl ( pH 7,4), 6 mM MgCl ₂ , 20 mM DTT, 4 mM spermidină, inhibitor RNază (40 U; Roche Diagnostics) și 0,5 mM ATP, CTP și GTP și 170 μCi de [ ³²P] UTP (800 Ci / mmol, 20 mCi / ml; Amersham) pentru riboprobile care vor fi utilizate pentru hibridizarea nordică sau 0,5 mM ATP și GTP și 250 μCi de ³⁵ S-UTP și ³⁵ S-CTP (10 mCi / ml, > 1.000 Ci / mmol; Amersham) pentru riboprobile care vor fi utilizate pentru hibridizarea in situ. ADN-ul plasmidic a fost digerat cu DNază fără RNază (10 U; Roche Diagnostics) în prezența unui amestec de 25 μg de ARNt drojdie, 40 mM Tris-HCl (pH 7,4), 6 mM MgCl ₂ , 10 mM DTT, 4 mM spermidină și inhibitor al RNazei (40 U; Roche Diagnostics) timp de 15 min la 37 ° C. S-a efectuat o extracție cu fenol-cloroform, iar faza superioară a fost transferată pe o coloană G-50 Sephadex pentru a elimina nucleotidele marcate cu radiomarcă. Pentru hibridizare in situ, sonde au fost hidrolizate în prezența a 40 mM NaHCC ₃-60 mM Na ₂ CO ₃ timp de 15 min la 60 ° C, urmată de o etapă de neutralizare și precipitare cu 91 mM acetat de sodiu , 0,5% acid acetic 15 pg de drojdie ARNt-608 mM acetat de amoniu la care se adaugă 2,5 volume de etanol rece. Peletul de ARN a fost resuspendat în H ₂ O. Sondele marcate cu ³⁵ S au fost menținute în condiții reducătoare , prin adăugarea la o concentrație finală de 10 mM DTT.

Pentru hibridizarea nordică, ³² de riboprobii marcate cu P au fost diluate în tamponul de hibridizare (5% [greutate / volum] dodecil sulfat de sodiu [SDS], 400 mM NaPO ₄ , 1 mM EDTA, 1 mg / ml albumină serică bovină, 50% ( vol / vol) formamidă). Pentru hibridizarea in situ, ³⁵ de riboprobii marcate cu S au fost diluate în tamponul de hibridizare in situ (75% [vol / vol] formamidă, 3 × SSC [1 × SSC este 0,15 M NaCl plus 0,017 M citrat de sodiu], 0,1 × soluția Denhardt , 200 μg de ARNt drojdie / ml, 50 mM NaPO ₄ [pH 7,4], 0,1 g sulfat de dextran / ml) la o concentrație de 3,3 × 10 ⁴ cpm / µl.

Hibridizarea nordică. Cinci micrograme de ARN total denaturat au fost separate prin electroforeză pe un agaroză 1,5% (în greutate / volum) – 20 mM HEPES – 1 mM EDTA – 6% (vol / vol) gel de formaldehidă. Benzile au fost transferate peste noapte la o membrană de nylon încărcată pozitiv (Nytran; Xymotech, Mont-Royal, Québec, Canada) prin acțiune capilară în tampon 10 × SSC (1,5 M NaCl, 0,17 M citrat de sodiu, pH 7,0). Membrana a fost uscată la 65 ° C timp de 1 oră și apoi ARN-ul a fost fixat cu lumină UV. Membrana a fost colorată cu albastru de metilen pentru a verifica transferul adecvat. Prefibrizare (tampon de preibridare: 5% [în greutate / volum] SDS, 400 mM NaPO ₄ , 1 mM EDTA, 1 mg albumine serice bovine / ml, 50% [vol / vol] formamidă) timp de cel puțin 2 h la 60 ° C a precedat hibridizarea peste noapte la 60 ° C cu ³²Riboprobes marca P. Blotele au fost spălate timp de 20 min și apoi de două ori timp de 1 h în 0,1 × SSC – 0,1% (în greutate / volum) SDS – 1 mM EDTA la 70 ° C și expuse la filmul de autoradiografie Kodak X-OMAT ( 17 ).

Hibridizarea in situ. Hibridizarea in situ a fost efectuată cu o ușoară modificare a unui protocol publicat ( 46 ). Secțiunile de țesut cu grosimea de 5 până la 10 μm au fost fixate în soluție de paraformaldehidă tamponată cu fosfat de 4% (vol / vol) timp de 1 h la temperatura camerei și apoi spălate de două ori în soluție salină tamponată cu fosfat, pH 7,4. A fost realizat un tratament cu proteinaza K de 10 min la 37 ° C (0,1 pg / ml) , urmată de următoarele spălări de : 5 min în H ₂ O, 5 min în 0,1 M trietanolamină, 10 min în 0,1 trietanolamina M conținând 0,25% (vol / vol) anhidridă acetică, apoi 5 min în 2 × SSC. Spălările au fost urmate de deshidratare în băi gradate de etanol (50 până la 95% [vol / vol]). O etichetă ³⁵ S (10 ⁶⁾-cpm) s-a adăugat riboprobe pe fiecare secțiune de țesut și s-a efectuat o incubare peste noapte la 55 ° C într-o cameră umedă cu 75% (vol / vol) formamidă. Secțiunile au fost spălate cu 2 × SSC pentru a îndepărta excesul de tampon de hibridare și apoi au fost tratate timp de 45 min la 37 ° C cu RNază A (40 μg / ml) și, în final, s-au efectuat următoarele spălări: trei spălări de 10 min la temperatura camerei în 2 ×, 1 × și 0,5 × SSC și apoi o spălare timp de 45 min la 60 ° C în 0,1 × SSC. Secțiunile au fost deshidratate în etanol gradat (50 până la 100% [vol / vol]) înainte de acoperirea cu emulsie nucleară K-5 (Illford), expunere timp de 1 până la 2 luni la 4 ° C, apoi dezvoltare cu D19 (Kodak) pentru 2 min și fixare timp de 4 min cu tiosulfat de sodiu (30% [greutate / volum]). Țesuturile au fost deshidratate în băi gradate de etanol și contracarate cu cresil violet. Contragerea efectuată după procedura de hibridizare nu duce la o colorare tipică de Nissls. Nucleele neuronale au fost slab pătate și sunt mari și palide, în timp ce nucleele celulelor gliale au fost pătate puternic-purpurii-albastru și au dimensiuni mai mici (17 ). Diapozitivele au fost observate cu un microscop Eon 32 800 Nikon și un iluminator Darklite (Micro Video Instruments Inc., Avon, Mass.). Un semnal pozitiv a fost caracterizat printr-un număr semnificativ de boabe de argint dezvoltate pe celule în comparație cu fondul.